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En 1952, dos jóvenes argentinos, Ernesto Guevara y Alberto Granado, emprenden un viaje por carretera para descubrir la verdadera América Latina. Ernesto es un joven estudiante de medicina de 23 años de edad, especializado en leprología. Alberto es un bioquímico de 29 años. La película sigue a ambos jóvenes en su viaje de descubrimiento de la rica y compleja topografía humana y social del continente latinoamericano.

Los dos amigos dejan el familiar entorno de Buenos Aires en una desvencijada motocicleta Norton de 500 cc del año 1939, imbuidos de un romántico espíritu aventurero. La moto se avería, pero los viajeros prosiguen en autostop. Poco a poco, van tomando contacto con una Latinoamérica diferente, reflejada en las personas que encuentran en su viaje; el cambio en sus perspectivas parece encontrar reflejo en la variedad de la geografía por la que transitan. Su ruta los lleva hasta las alturas de Machu Pichu, donde las majestuosas ruinas y la extraordinaria presencia de la herencia Inca ejercen un profundo efecto sobre ambos. Al llegar a una colonia de leprosos en el corazón de la selva amazónica, los dos viajeros ya han comenzado a poner en cuestión el valor del progreso tal y como lo definen ciertos sistemas económicos, que dejan a tantos en la cuneta. Sus experiencias en la leprosería hacen que despierten en ellos los hombres en que se convertirán en el futuro y que definirán el recorrido ético y político de sus vidas.

Basándose en los diarios de Alberto Granado y del hombre que acabaría convirtiéndose en "el Che", Diarios de motocicleta es un viaje de autodescubrimiento en el que se esbozan los orígenes de un corazón revolucionario.